Chromatografie is een van de methoden om stoffen te scheiden. Het wordt gebruikt voor de daaropvolgende kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de fysische en chemische eigenschappen van microdeeltjes. Een variant van deze technologie is affiniteitschromatografie. Het idee om eiwitverbindingen te differentiëren met behulp van de eigenschap van moleculaire affiniteit is al tientallen jaren bekend in de wetenschap. Het heeft echter pas de laatste jaren zijn ontwikkeling gekregen, na de introductie van zeer poreuze hydrofiele materialen die als matrix worden gebruikt. Met deze methode kunnen zowel analytische problemen (scheiding van stoffen en hun identificatie) als voorbereidende problemen (zuivering, concentratie) worden opgelost.
Essentie
Affiniteitschromatografie (van het Latijnse woord affinis - "aangrenzend", "gerelateerd") is gebaseerd op affiniteitsinteracties, die de vorming zijn van zeer specifieke bindingen tussen een spacermolecuul (ligand of affinant) en een doelmolecuul. Deze mechanismen zijn wijdverbreid van aard (verbinding van mediatoren of hormonen en receptoren, antilichamen enantigenen, hybridisatie van polynucleotiden en andere soorten processen). In de geneeskunde wordt affiniteitschromatografie al sinds 1951 voor praktische doeleinden gebruikt
De componenten zijn als volgt gescheiden:
- werkoplossing die de te isoleren stof bevat, wordt door het sorptiemiddel geleid;
- ligand afgezet op de sorptiematrix houdt deze stof vast;
- het is geconcentreerd (accumulatie);
- extractie van de geïsoleerde stof uit het sorptiemiddel door wassen met een oplosmiddel.
Met deze methode kun je hele cellen isoleren. Het verschil met traditionele sorptiechromatografie is dat er een sterke biospecifieke binding is van de geïsoleerde component aan het sorptiemiddel, dat wordt gekenmerkt door een hoge selectiviteit.
Adsorbentia
De volgende stoffen worden gebruikt als adsorbens:
- Gelverbindingen op basis van agarose, een polysacharide verkregen uit agar. De meest gebruikte zijn 3 varianten: sepharose 4B, CL (cross-linked agarose) en affi-gel. De laatstgenoemde samenstelling is een gemodificeerde gel van agarose en polyacrylamide. Het heeft een grotere biologische inertie, een hoge chemische en thermische weerstand.
- Silicium (silicagel).
- Glas.
- Organische polymeren.
Om mechanische obstakels tijdens ligandcontact te elimineren, worden extra stoffen gebruikt om het van de drager te scheiden (peptiden, diaminen, polyaminen, oligosachariden).
Apparatuur
Affiniteitschromatografieapparatuur omvat de volgende hoofdeenheden:
- opslagtanks voor de mobiele fase (eluens);
- hogedrukpompen voor mediumtoevoer (meestal reciprocerend);
- filter voor het reinigen van loopvloeistoffen van stof;
- doseerapparaat;
- chromatografische kolom voor mengselscheiding;
- detector voor het detecteren van gescheiden componenten die de kolom verlaten;
- chromatogramrecorders en microprocessoreenheid (computer).
Om de hoeveelheid opgeloste lucht te verminderen, wordt helium eerst door de mobiele fase geleid. Om de concentratie van het eluens te wijzigen, zijn verschillende pompen geïnstalleerd die door de programmeur worden bestuurd. Chromatografische kolommen zijn gemaakt van roestvrij staal (voor verhoogde eisen aan corrosieweerstand), glas (universele optie) of acryl. Voor preparatieve doeleinden kan hun diameter variëren van 2 tot 70 cm Bij analytische chromatografie worden microkolommen van Ø10-150 µm gebruikt.
Om de gevoeligheid van de detectoren te vergroten, worden reagentia in het mengsel gebracht, die bijdragen aan de vorming van stoffen die meer stralen absorberen in het ultraviolette of zichtbare deel van het spectrum.
Methodologie
Er zijn 2 hoofdtypen vloeistofaffiniteitschromatografie:
- Kolom, waarin de kolom wordt gevuld met een stationaire fase en er een mengsel doorheen wordt geleid met een stroomeluent. Scheiding kan plaatsvinden onder druk of onder zwaartekracht.
- Dunne laag. Het eluens beweegt onder invloed van capillaire krachten langs de vlakke adsorberende laag. Het adsorbens wordt aangebracht op een glasplaat, keramische of kwartsstaaf, metaalfolie.
Hoofdstadia van het werk zijn:
- bereiding van het adsorbens, fixatie van het ligand op de drager;
- voeding van het scheidingsmengsel aan de chromatografische kolom;
- mobiele fase laden, componentbinding door ligand;
- fasevervanging om de gebonden stof te isoleren.
Bestemming
Affiniteitschromatografie wordt gebruikt om de volgende soorten stoffen te isoleren (het gebruikte type ligand wordt tussen haakjes aangegeven):
- analogen van enzymatische remmers, substraten en cofactoren (enzymen);
- bio-organische stoffen met tekenen van genetische vreemdheid, virussen en cellen (antilichamen);
- koolhydraten met hoog molecuulgewicht, monosacharidepolymeren, glycoproteïnen (lectines);
- nucleaire eiwitten, nucleotidyltransferasen (nucleïnezuren);
- receptoren, transporteiwitten (vitamines, hormonen);
- eiwitten die interageren met celmembranen (cellen).
Deze technologie wordt ook gebruikt om geïmmobiliseerde enzymen te verkrijgen, en door ze te binden aan cellulose kunnen immunosorbentia worden geproduceerd.
Chromatografie van DNA-bindende eiwitten
Isolatie van DNA-bindende eiwitten wordt uitgevoerd met behulp vanheparine. Dit glycosaminoglycaan kan een breed scala aan moleculen binden. Affiniteitschromatografie van eiwitten van deze groep wordt gebruikt om stoffen te isoleren zoals:
- factoren van initiatie en verlenging van translatie (synthese van nucleïnezuurmoleculen en eiwitten);
- restrictasen (enzymen die bepaalde sequenties in dubbelstrengs DNA herkennen);
- DNA-ligasen en -polymerasen (enzymen die de samenvoeging van twee moleculen katalyseren om een nieuwe chemische binding te vormen en die betrokken zijn bij DNA-replicatie);
- serineproteaseremmers die een belangrijke rol spelen bij immuun- en ontstekingsprocessen;
- groeifactoren: fibroblast, Schwann, endotheel;
- eiwitten van extracellulaire matrix;
- hormoonreceptoren;
- lipoproteïnen.
Waardigheid
Deze methode is een van de meest specifieke voor de isolatie van reactieve verbindingen (enzymen en grotere aggregaten - virussen). Het wordt echter niet alleen gebruikt om biologisch actieve stoffen te isoleren.
Detectie van antilichamen in kleine hoeveelheden, kwantitatieve beoordeling van polyadenylzuur, snelle bepaling van de molecuulmassa's van dehydrogenasen, verwijdering van bepaalde verontreinigende stoffen, studie van de kinetiek van activering van de inactieve vorm van trypsine, de moleculaire structuur van de mens interferonen - dit is niet de hele lijst van onderzoeken waarin affiniteit wordt gebruikt chromatografie. Het gebruik in de kliniek is te danken aan de voordelen zoals:
- Effectieve reinigingeiwitten, polysachariden, nucleïnezuren. Ze verschillen enigszins in hun fysische en chemische eigenschappen en verliezen activiteit tijdens hydrolyse, denaturatie en andere soorten behandelingen die bij andere methoden worden gebruikt.
- De snelheid van scheiding van stoffen, de dynamische aard van het proces.
- Geen speciale enzymzuivering en isoenzymhomogenisatie nodig om dissociatieconstanten te bepalen.
- Kan een breed scala aan stoffen scheiden.
- Laag verbruik van liganden.
- Mogelijkheid om stoffen in grote volumes te scheiden.
- Omkeerbaar proces van binding van biologische macromoleculen.
Deze techniek kan met andere worden gecombineerd om een extra veld op te leggen (zwaartekracht, elektromagnetisch). Hierdoor kunt u de technische mogelijkheden van chromatografie uitbreiden.
Enzymatische techniek
Dankzij deze methode begon de actieve ontwikkeling van een nieuwe tak van biotechnologie - enzymtechnologie.
Affiniteitschromatografie voor enzymisolatie heeft de volgende voordelen:
- het verkrijgen van enzymen in grote hoeveelheden als gevolg van minder tijd, als resultaat - hun prijsverlaging;
- immobilisatie van enzymen kan de reikwijdte van hun toepassing in de geneeskunde en de industrie aanzienlijk vergroten;
- De associatie van enzymen met een onoplosbare vaste drager maakt het mogelijk om de invloed van de micro-omgeving en de richting van reacties te bestuderen, die een belangrijke rol spelen in natuurlijke en fysiologische processen.
