PCR, of polymerasekettingreactie, is een geavanceerde laboratoriumtechniek die veel wordt gebruikt in de geneeskunde en andere wetenschappelijke gebieden. PCR-diagnostiek werd ooit een echte doorbraak in de wetenschap.
Beschrijving
Kwantitatieve PCR is een soort real-time PCR.
Dit wordt opgevat als een variant van PCR, waarbij de kinetiek van de reactie constant wordt geregistreerd, wat het mogelijk maakt om de inhoud van specifieke DNA-nucleotidesequenties in een complex moleculair mengsel kwalitatief te evalueren.
Kwantitatieve PCR-methode zal hieronder in meer detail worden besproken.
De essentie van de analyse
Culturele en serologische methoden worden vooral vaak gebruikt om infecties te diagnosticeren. Onder de eerste worden antilichamen tegen een infectieus pathogeen in het bloedserum bepaald. In het tweede geval wordt biologisch materiaal van een zieke gebruikt om een specifiek medium te zaaien dat gunstig is voor de groei van pathogene kolonies. Diagnostiek in beidezaak kan dagen of weken duren.
PCR-onderzoek kan worden uitgevoerd met verschillende biologische materialen die afkomstig zijn van een zieke. Bloed en andere pathologische, fysiologische en biologische media en vloeistoffen fungeren als monsters. U kunt PCR ontlasting of urine doen.
Atypische en virale infecties worden meestal gediagnosticeerd door kwantitatieve PCR, omdat ze misschien niet gemakkelijk te diagnosticeren zijn vanwege de specifieke aard van het pathologische proces dat ze veroorzaken. Om dergelijke infecties te bepalen, kost het tijd, waarin antilichamen in het lichaam worden geproduceerd, bepaald door serologische methoden. Maar dit is in sommige gevallen onaanvaardbaar.
Uitvoeringsmethode
PCR-methode - laboratoriumdetectie van infectie in monsters geïsoleerd van de patiënt (in vitro).
Voor het uitvoeren van een polymerasekettingreactie is een set speciale reagentia vereist.
Het testmateriaal wordt met reagentia in reageerbuizen gebracht. De reageerbuizen worden in een speciaal apparaat geplaatst - een PCR-versterker, die is ontworpen om de gewenste RNA- of DNA-fragmenten te amplificeren (het aantal te vergroten), de PCR-versterker werkt in een cyclische modus. In elke cyclus, als de monsters de RNA- of DNA-sequentie van de ziekteverwekker bevatten, hopen zich steeds meer kopieën van de deeltjes van deze nucleïnezuren op in de oplossing. U kunt de aanwezigheid van de ziekteverwekker en de hoeveelheid ervan in de monsters bepalen.
Typen PCR
Kwalitatieve analyse door PCR stelt u in staat om het volgende resultaat te krijgen:
- negatief wanneer het pathogeen van belang niet in de monsters wordt gevonden;
- positief als in de monsters sequenties worden gevonden die kenmerkend zijn voor een bepaalde ziekteverwekker.
Bij een positief PCR-resultaat kunnen we met 95% nauwkeurigheid spreken over de aanwezigheid van een gediagnosticeerde infectie. Tegelijkertijd bereikt de nauwkeurigheid van PCR-sets die voor diagnostische doeleinden worden gebruikt 100%.
Meestal wordt 5% van de onjuiste resultaten bepaald door de menselijke factor. Schendingen van de techniek van analyse en opslag van reagentia kunnen bijvoorbeeld de nauwkeurigheid van het onderzoek aanzienlijk verminderen.
Kwantitatieve PCR definieert het concept van virale belasting. Het is mogelijk om te bepalen hoeveel sets pathogeen-DNA zich in de monsters van de patiënt bevonden.
De ernst van de infectie is recht evenredig met de toename van hun aantal. U kunt ook het succes van therapie om de virale belasting te verminderen bepalen.
Inzending voor PCR-biomateriaal
Kwantitatieve PCR wordt voornamelijk 's ochtends in de kliniek uitgevoerd. Tijdens een bezoek aan de arts wordt de patiënt verteld wat er moet worden ingenomen: schrapen, uitstrijkjes, urine of bloed. PCR kan ziekteverwekkers detecteren ongeacht de mate van verontreiniging van het materiaal.
Voor een positieve analyse is in theorie de aanwezigheid van slechts één pathogeen in de monsters vereist. In de praktijk proberen ze nog gunstiger voorwaarden te scheppen. Hiervoor zijn enkele aanbevelingen:
- als ze een schraapsel of een uitstrijkje van de geslachtsdelen nemenorganen, moet u zich drie dagen voor het onderzoek onthouden van intieme gemeenschap;
- je kunt niet douchen met antibacteriële medicijnen of jezelf wassen voor de analyse;
- drie uur voordat je een uitstrijkje van de plasbuis neemt, moet je geduld hebben en je darmen niet legen.
Volg deze regels niet bij het doneren van bloed.
Hoe worden de resultaten van kwantitatieve PCR-analyse geïnterpreteerd?
Kwantitatieve evaluatie van de verkregen resultaten
In een aantal klinische situaties komt het probleem van de effectiviteit van de behandeling en/of de dynamiek van het pathologieproces naar voren. Dergelijke vragen zijn vooral relevant bij het onderzoek van mensen met chronische infecties (humaan immunodeficiëntievirus, hepatitis B en C). Bij de diagnose zijn ze gebaseerd op het feit dat de accumulatie van amplicons (PCR-producten) evenredig is met de aanwezigheid van kopieën van het gewenste gen in het geanalyseerde monster.
Natuurlijk wordt rekening gehouden met de resultaten van kwantitatieve PCR door gelelektroforese met de studie van de intensiteit van speciale PCR-signalen. Een voorwaarde voor een correcte kwantitatieve beoordeling van de verkregen resultaten zijn ook positief betrouwbare controlemonsters die een bekend aantal kopieën van het gewenste gen bevatten (bijvoorbeeld duizend kopieën van het hepatitis C-gen voor één PCR-reactie). Met verschillende seriële verdunningen van de kwantitatieve controle kunnen kalibratiecurves worden gegenereerd en worden gebruikt om het geh alte aan klinische genokopieën in klinische monsters te evalueren.
In de definitie van kwantitatieve PCR is een belangrijke prestatie de creatie geweestfluorescerende DNA-probes die gelijktijdig met eenvoudige primers aan het reactiemengsel worden toegevoegd en waarmee u het PCR-proces op tijd kunt volgen, dat wil zeggen re altime PCR.
De TaqMan-methodologie verwijst naar de synthese van fluorescerende DNA-probes die specifiek zijn voor het middelste deel van het amplicon en die aan de uiteinden twee labels hebben. Een daarvan is een fluorescerend label, de tweede is een quencher-molecuul voor deze fluorescentie.
Een speciaal apparaat, dat een hybride is van een fluorimeter en een thermoblok-versterker, meet constant de fluorescentie in elke reageerbuis (real-time PCR-principe). Na 20-40 PCR-cycli zullen voor elk monster individuele curven worden verkregen. Het aantal kopieën van het gewenste gen dat zich in het testmonster bevindt, kan worden berekend uit kalibratiecurven met controlemonsters.
Een belangrijk kenmerk van de implementatie van PCR door de fluorescerende methode is ook dat het niet nodig is om buisjes te openen met een PCR-mengsel wanneer rekening wordt gehouden met de resultaten. Dit vermindert de kans op verontreiniging van de ruimte met versterkingsproducten en het is niet nodig om speciale werkgebieden toe te wijzen voor elektroforese.
Wat laat een kwantitatief PCR-transcript zien?
Wat wordt er ontdekt?
Via een methode als kwantitatieve PCR worden kwalitatieve veranderingen in genen gevonden: inserties, deleties en puntmutaties. Maar bij sommige erfelijke aandoeningen verschijnen de overeenkomstige symptomen als reactie op een verandering in de inhoud van bepaalde genen.
BedanktKwantitatieve analyse geeft een numeriek resultaat, meestal in IE / ml. Dit betekent dat in één milliliter van het testmonster een bepaald aantal kopieën van het RNA of DNA van de ziekteverwekker is gevonden, gemeten in internationale eenheden.
Afhankelijk van de omvang wordt de ernst van de infectie vastgesteld. Bloed wordt meestal getest om de virale belasting te bepalen, aangezien virussen tijdens ziekte vrij in het bloed kunnen bewegen.
Kenmerken
Kwantitatieve PCR in een bloedtest heeft twee kenmerken.
- De analyse wordt uitgevoerd in aanwezigheid van primers of deoxyribonucleosidetrifosfaten, die zijn gelabeld met een fluorescerend of radioactief label om het geh alte van het gevormde PCR-product nauwkeurig te bepalen.
- Beëindig in het PCR-proces de reactie eerder voordat er te veel PCR-producten verschijnen. Dit komt door het feit dat in het laatste stadium van verzadiging, wanneer er veel PCR-producten zijn, zowel het enzym zelf als de substraten fungeren als de beperkende schakels van deze reactie. Het einde van de volgende PCR-cyclus onder dergelijke omstandigheden wordt niet langer gekenmerkt door een verdubbeling van het aantal PCR-producten, onbeduidende kwantitatieve verschillen tussen verschillende monsters worden geëgaliseerd, die vrij duidelijk worden gedefinieerd in de vroege stadia na het doorlopen van een reeks reactiecycli.
Kosten van PCR-diagnostiek
PCR-onderzoek heeft een prijs, die afhankelijk is van het soort infectie dat wordt getest, van de analysemethodologie en het testmateriaal. Om één infectie vast te stellen, moet u binnen geven200-800 roebel. Er wordt ook een vergoeding voor het nemen van biomateriaal toegevoegd - ongeveer 400 roebel.
