Recombinant DNA zijn moleculen die zijn gevormd door genetische recombinatietechnieken in laboratoria om genetisch materiaal uit meerdere bronnen te combineren. Het is mogelijk omdat de DNA-moleculen van alle organismen dezelfde chemische structuur hebben en alleen verschillen in de nucleotidesequentie erin.
Creatie
Moleculair klonen is een laboratoriumproces dat wordt gebruikt om recombinant DNA te maken. Het is een van de twee meest gebruikte methoden, samen met de polymerasekettingreactie (PCR). Hiermee kunt u de replicatie van een bepaalde DNA-sequentie die door de onderzoeker is gekozen, regelen.
Er zijn twee fundamentele verschillen tussen recombinant-DNA-methoden. Een daarvan is dat moleculair klonen replicatie in een levende cel omvat, terwijl PCR in vitro omvat. Een ander verschil is dat de eerste methode het knippen en plakken van DNA-sequenties mogelijk maakt, terwijl de tweede wordt verbeterd door de bestaande volgorde te kopiëren.
Vector DNA
Recombinant DNA verkrijgen vereist een kloneringsvector. Het is afgeleid van plasmiden of virussen en is een relatief klein segment. De keuze van de vector voor moleculaire klonering hangt af van de keuze van het gastheerorganisme, de grootte van het te kloneren DNA en of vreemde moleculen tot expressie moeten worden gebracht. Segmenten kunnen worden gecombineerd met behulp van verschillende methoden, zoals restrictie-enzym/ligase-klonering of Gibson-assemblage.
Klonen
In standaardprotocollen omvat klonen zeven stappen.
- Selecteer gastheerorganisme en kloneringsvector.
- Een DNA-vector verkrijgen.
- Vorming van gekloond DNA.
- Creatie van recombinant DNA.
- Introductie in het gastheerorganisme.
- Selectie van organismen die het bevatten.
- Selectie van klonen met gewenste DNA-inserts en biologische eigenschappen.
Na transplantatie in het gastheerorganisme kunnen de vreemde moleculen in het recombinante construct al dan niet tot expressie worden gebracht. Expressie vereist herstructurering van het gen om sequenties op te nemen die nodig zijn voor DNA-productie. Het wordt gebruikt door de vertaalmachine van de host.
Hoe het werkt
Recombinant DNA werkt wanneer de gastheercel een eiwit van recombinante genen tot expressie brengt. Expressie hangt af van het omringen van het gen met een reeks signalen die instructies geven voor de transcriptie ervan. Ze omvatten promotor, ribosoombinding en terminator.
Er ontstaan problemen als het genbevat introns of signalen die fungeren als terminators voor de bacteriële gastheer. Dit leidt tot voortijdige beëindiging. Het recombinante eiwit kan onjuist worden verwerkt, gevouwen of afgebroken. De productie ervan in eukaryote systemen vindt meestal plaats in gisten en draadschimmels. Het gebruik van dierenkooien is moeilijk vanwege de behoefte aan een sterk draagvlak voor velen.
Eigenschappen van organismen
Organismen die recombinante DNA-moleculen bevatten, hebben schijnbaar normale fenotypes. Hun uiterlijk, gedrag en metabolisme veranderen meestal niet. De enige manier om de aanwezigheid van recombinante sequenties aan te tonen, is door het DNA zelf te onderzoeken met behulp van de polymerasekettingreactietest.
In sommige gevallen kan recombinant DNA schadelijke effecten hebben. Dit kan gebeuren wanneer het fragment dat een actieve promotor bevat zich naast een voorheen stil gastheercelgen bevindt.
Gebruik
Recombinant-DNA-technologie wordt veel gebruikt in de biotechnologie, geneeskunde en onderzoek. De eiwitten en andere producten zijn te vinden in bijna elke westerse apotheek, dierenkliniek, dokterspraktijk, medisch of biologisch laboratorium.
De meest voorkomende toepassing is in fundamenteel onderzoek, waar technologie essentieel is voor veel van het huidige werk in de biologische en biomedische wetenschappen. Recombinant DNA wordt gebruikt om genen te identificeren, in kaart te brengen en te sequencen, en om ze te bepalenfuncties. rDNA-probes worden gebruikt om genexpressie in afzonderlijke cellen en in weefsels van hele organismen te analyseren. Recombinante eiwitten worden gebruikt als reagentia in laboratoriumexperimenten. Hieronder worden enkele specifieke voorbeelden gegeven.
Recombinant chymosine
Cymosine, gevonden in de lebmaag, is een enzym dat nodig is om kaas te maken. Het was het eerste genetisch gemodificeerde voedseladditief dat in de industrie werd gebruikt. Een microbiologisch geproduceerd recombinant enzym dat structureel identiek is aan een van een kalf afgeleid enzym is goedkoper en wordt in grotere hoeveelheden geproduceerd.
Recombinante humane insuline
Vrijwel vervangende insuline afkomstig van dierlijke bronnen (bijv. varkens en runderen) voor de behandeling van insulineafhankelijke diabetes. Recombinante insuline wordt gesynthetiseerd door het gen voor humane insuline in bacteriën van het geslacht Eterichia of gist te introduceren.
Groeihormoon
Voorgeschreven voor patiënten van wie de hypofyse niet genoeg groeihormoon produceert om een normale ontwikkeling te ondersteunen. Voordat recombinant groeihormoon beschikbaar kwam, werd het verkregen uit de hypofyse van kadavers. Deze onveilige praktijk heeft ertoe geleid dat sommige patiënten de ziekte van Creutzfeldt-Jakob hebben ontwikkeld.
Recombinante stollingsfactor
Dit is een bloedstollingseiwit dat wordt toegediend aan patiënten met vormen van hemofilie met bloedingsstoornissen. Ze zijn niet in staat om te producerenfactor VIII in voldoende hoeveelheden. Voorafgaand aan de ontwikkeling van recombinant factor VIII werd het eiwit gemaakt door grote hoeveelheden menselijk bloed van meerdere donoren te verwerken. Dit bracht een zeer hoog risico op overdracht van infectieziekten met zich mee.
Diagnose van HIV-infectie
Elk van de drie veelgebruikte methoden voor het diagnosticeren van HIV-infectie is ontwikkeld met behulp van recombinant DNA. Een antilichaamtest gebruikt haar eiwit. Het detecteert de aanwezigheid van genetisch materiaal van HIV met behulp van een omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie. De ontwikkeling van de test werd mogelijk gemaakt door moleculaire klonering en sequencing van de hiv-genomen.
