Om de kwalitatieve samenstelling van veel voedingsproducten vast te stellen, wordt de xantoproteïnereactie voor eiwitten gebruikt. De aanwezigheid van aromatische aminozuren in de verbinding geeft een positieve kleurverandering aan het testmonster.
Wat is eiwit
Het wordt ook wel een eiwit genoemd, een bouwstof voor een levend organisme. Eiwitten behouden het spiervolume, herstellen gewonde en dode weefselstructuren van verschillende organen, of het nu haar, huid of ligamenten zijn. Met hun deelname worden rode bloedcellen geproduceerd, de normale werking van veel hormonen en cellen van het immuunsysteem wordt gereguleerd.
Dit is een complex molecuul, een polypeptide met een massa groter dan 6103 d altons. De eiwitstructuur wordt gevormd door aminozuurresten in grote hoeveelheden, verbonden door een peptidebinding.
Eiwitstructuur
Een onderscheidend kenmerk van deze stoffen in vergelijking met peptiden met een laag molecuulgewicht is hun ontwikkelde ruimtelijke driedimensionale structuur, ondersteund door invloeden van verschillendemate van aantrekkingskracht. Eiwitten hebben een structuur met vier niveaus. Elk van hen heeft zijn eigen kenmerken.
De primaire organisatie van hun moleculen is gebaseerd op de aminozuursequentie, waarvan de structuur wordt herkend door de xantoproteïnereactie op het eiwit. Een dergelijke structuur is een periodiek herhalende peptidebinding -HN-CH-CO-, en de zijketenradicalen in aminocarbonzuren zijn het selectieve deel. Zij zijn het die in de toekomst de eigenschappen van de stof als geheel bepalen.
De primaire eiwitstructuur wordt als sterk genoeg beschouwd, dit komt door de aanwezigheid van sterke covalente interacties in peptidebindingen. De vorming van volgende niveaus vindt plaats afhankelijk van de tekens die in de beginfase zijn vastgesteld.
De vorming van een secundaire structuur is mogelijk door de verdraaiing van de aminozuursequentie tot een spiraal, waarin waterstofbruggen tot stand komen tussen de windingen.
Het tertiaire organisatieniveau van een molecuul wordt gevormd wanneer een deel van de helix wordt gesuperponeerd op andere fragmenten met het ontstaan van allerlei soorten bindingen ertussen, met een waterstof-, disulfide-, covalente of ionische verbinding. Het resultaat zijn associaties in de vorm van bolletjes.
De ruimtelijke rangschikking van tertiaire structuren met de vorming van chemische bindingen daartussen leidt tot de vorming van de uiteindelijke vorm van het molecuul of het quaternaire niveau.
Aminozuren
Ze bepalen de chemische eigenschappen van eiwitten. Er zijn ongeveer 20 hoofdaminozuren,opgenomen in de samenstelling van de polypeptiden in verschillende sequenties. Dit omvat ook zeldzame aminocarbonzuren in de vorm van hydroxyproline en hydroxylysine, die derivaten zijn van basische peptiden.
Als teken van de xantoproteïnereactie van eiwitherkenning, geeft de aanwezigheid van individuele aminozuren een verandering in de kleur van de reagentia, wat de aanwezigheid van specifieke structuren in hun samenstelling suggereert.
Het bleek dat het allemaal carbonzuren zijn, waarin het waterstofatoom is vervangen door een aminogroep.
Een voorbeeld van de structuur van een molecuul is de structuurformule van glycine (HNH− HCH− COOH) als het eenvoudigste aminozuur.
In dit geval kan een van de waterstofatomen CH2- koolstof worden vervangen door een langere radicaal, waaronder een benzeenring, amino, sulfo, carboxygroepen.
Wat betekent de xantoproteïne-reactie
Er worden verschillende methoden gebruikt voor kwalitatieve eiwitanalyse. Deze omvatten reacties:
- biuret met paarse kleur;
- ninhydrine om een blauw-violette oplossing te vormen;
- formaldehyde met rode verkleuring;
- Folie met grijszwarte sedimentatie.
Bij het uitvoeren van elke methode wordt de aanwezigheid van eiwitten en de aanwezigheid van een bepaalde functionele groep in hun molecuul bewezen.
Er is een xantoproteïne-reactie op eiwit. Het wordt ook wel de Mulder-test genoemd. Het verwijst naar kleurreacties op eiwitten, indie aromatische en heterocyclische aminozuren zijn.
Een kenmerk van een dergelijke test is het proces van nitrering van cyclische aminozuurresiduen met salpeterzuur, in het bijzonder de toevoeging van een nitrogroep aan de benzeenring.
Het resultaat van dit proces is de vorming van een nitroverbinding, die neerslaat. Dit is het belangrijkste teken van een xantoproteïnereactie.
Welke aminozuren worden bepaald
Niet alle aminocarbonzuren kunnen met deze test worden gedetecteerd. Het belangrijkste kenmerk van de xantoproteïnereactie van eiwitherkenning is de aanwezigheid van een benzeenring of heterocyclus in het aminozuurmolecuul.
Uit eiwitaminocarbonzuren worden twee aromatische zuren geïsoleerd, waarin zich een fenylgroep (in fenylalanine) en een hydroxyfenylradicaal (in tyrosine) bevindt.
De xantoproteïnereactie wordt gebruikt om het heterocyclische aminozuur tryptofaan te bepalen, dat een aromatische indoolkern heeft. De aanwezigheid van bovenstaande verbindingen in het eiwit geeft een karakteristieke kleurverandering van het testmedium.
Welke reagentia worden gebruikt
Om de xantoproteïne-reactie uit te voeren, moet u een 1% -oplossing van ei of plantaardig eiwit bereiden.
Gebruik gewoonlijk een kippenei, dat wordt gebroken om het eiwit verder van de dooier te scheiden. Om een oplossing te verkrijgen, wordt 1% eiwit verdund in tien keer de hoeveelheid gezuiverd water. Na het oplossen van het eiwit moet de resulterende vloeistof door verschillende lagen gaas worden gefilterd. Deze oplossing moet op een koele plaats worden bewaard.
Je kunt de reactie uitvoeren met plantaardig eiwit. Om de oplossing te bereiden, wordt tarwebloem gebruikt in een hoeveelheid van 0,04 kg. Voeg 0,16 l gezuiverd water toe. De ingrediënten worden gemengd in een kolf, die 24 uur op een koude plaats met een temperatuur van ongeveer + 1 ° C wordt geplaatst. Na een dag wordt de oplossing geschud, waarna deze eerst wordt gefilterd met watten en vervolgens met een papieren plisséfilter. De resulterende vloeistof wordt op een koude plaats bewaard. In zo'n oplossing is er voornamelijk een albuminefractie.
Om de xantoproteïnereactie uit te voeren, wordt geconcentreerd salpeterzuur als hoofdreagens gebruikt. Aanvullende reagentia zijn een oplossing van 10% natriumhydroxide of ammoniak, een gelatine-oplossing en niet-geconcentreerde fenol.
Methodologie
Voeg in een schone reageerbuis een 1% oplossing van ei-eiwit of bloem toe in een hoeveelheid van 2 ml. Er worden ongeveer 9 druppels geconcentreerd salpeterzuur aan toegevoegd om te voorkomen dat de vlokken eruit vallen. Het resulterende mengsel wordt verwarmd, als resultaat wordt het neerslag geel en verdwijnt geleidelijk, en de kleur gaat in oplossing.
Als de vloeistof afkoelt, worden ongeveer 9 druppels geconcentreerde natriumhydroxide toegevoegd aan de reageerbuis langs de wand, wat een overmaat is voor het proces. De reactie van het medium wordt alkalisch. De inhoud in de tube wordt oranje.
Kenmerken
Aangezien xantoproteïne een kwalitatieve reactie op eiwitten wordt genoemd onderdoor de werking van salpeterzuur, dan wordt de test uitgevoerd onder de meegeleverde zuurkast. Neem alle veiligheidsmaatregelen in acht bij het werken met geconcentreerde bijtende stoffen.
Tijdens het verwarmingsproces kan de inhoud van de buis worden uitgeworpen, waarmee rekening moet worden gehouden bij het bevestigen in de houder en het kiezen van een helling.
Het innemen van geconcentreerd salpeterzuur en natriumhydroxide mag alleen worden gedaan met een glazen pipet en een rubberen bol, het is verboden om via de mond te typen.
Vergelijkende reactie met fenol
Om het proces te illustreren en de aanwezigheid van de fenylgroep te bevestigen, wordt een soortgelijke test uitgevoerd met hydroxybenzeen.
Introduceer 2 ml verdunde fenol in een reageerbuis en voeg dan geleidelijk, langs de wand, 2 ml geconcentreerd salpeterzuur toe. De oplossing wordt verwarmd, waardoor deze geel wordt. Deze reactie is kwalitatief voor de aanwezigheid van een benzeenring.
Het proces van nitrering van hydroxybenzeen met salpeterzuur gaat gepaard met de vorming van een mengsel van paranitrofenol en orthonitrofenol in een procentuele verhouding van 15 tot 35.
Gelatine vergelijking
Om te bewijzen dat de xantoproteïne-reactie op een eiwit alleen aminozuren met een aromatische structuur detecteert, worden eiwitten gebruikt die geen fenolische groep hebben.
Introduceer 1% gelatine-oplossing in een hoeveelheid van 2 ml in een schoon reageerbuisje. Er worden ongeveer 9 druppels geconcentreerd salpeterzuur aan toegevoegd. Het resulterende mengsel wordt verwarmd. De oplossing wordt niet geel, wat de afwezigheid bewijstaminozuren met een aromatische structuur. Lichte vergeling van het medium wordt soms waargenomen door de aanwezigheid van eiwitonzuiverheden.
Chemische vergelijkingen
De xantoproteïne-reactie op eiwitten vindt plaats in twee fasen. De formule van de eerste fase beschrijft het proces van nitrering van een aminozuurmolecuul met behulp van geconcentreerd salpeterzuur.
Een voorbeeld is de toevoeging van een nitrogroep aan tyrosine om nitrotyrosine en dinitrotyrosine te vormen. In het eerste geval wordt één NO2-radicaal aan de benzeenring vastgemaakt en in het tweede geval worden twee waterstofatomen vervangen door NO2. De chemische formule van de xantoproteïnereactie wordt weergegeven door de interactie van tyrosine met salpeterzuur om een nitrotyrosinemolecuul te vormen.
Het proces van nitrering gaat gepaard met de overgang van een kleurloze kleur naar een gele tint. Wanneer een soortgelijke reactie wordt uitgevoerd met eiwitten die aminozuurresten van tryptofaan of fenylalanine bevatten, verandert ook de kleur van de oplossing.
In de tweede fase interageren de nitreringsproducten van het tyrosinemolecuul, in het bijzonder nitrotyrosine, met ammonium- of natriumhydroxide. Het resultaat is natrium- of ammoniumzout, dat geeloranje van kleur is. Deze reactie houdt verband met het vermogen van het nitrotyrosinemolecuul om in de chinoïdevorm over te gaan. Later wordt daaruit een zout van salpeterzuur gevormd, dat een chinonsysteem van dubbele geconjugeerde bindingen heeft.
Dit is hoe de xantoproteïne-reactie op eiwitten eindigt. vergelijking tweefase is hierboven weergegeven.
Resultaten
Tijdens de analyse van vloeistoffen in drie reageerbuizen dient verdunde fenol als referentieoplossing. Stoffen met een benzeenring geven een kwalitatieve reactie met salpeterzuur. Als gevolg hiervan verandert de kleur van de oplossing.
Zoals je weet, bevat gelatine collageen in gehydrolyseerde vorm. Dit eiwit bevat geen aromatische aminocarbonzuren. Bij interactie met zuur is er geen verandering in de kleur van het medium.
In de derde reageerbuis wordt een positieve xantoproteïne-reactie op eiwitten waargenomen. De conclusie kan als volgt worden getrokken: alle eiwitten met een aromatische structuur, of het nu een fenylgroep of een indolring is, geven een kleurverandering aan de oplossing. Dit komt door de vorming van gele nitroverbindingen.
Het uitvoeren van een kleurreactie bewijst de aanwezigheid van een verscheidenheid aan chemische structuren in aminozuren en eiwitten. Het gelatinevoorbeeld laat zien dat het aminocarbonzuren bevat die geen fenylgroep of cyclische structuur hebben.
De xantoproteïne-reactie kan de geelverkleuring van de huid verklaren wanneer er sterk salpeterzuur op wordt aangebracht. Melkschuim krijgt dezelfde kleur als er een dergelijke analyse mee wordt uitgevoerd.
In de medische laboratoriumpraktijk wordt dit kleurmonster niet gebruikt om eiwit in de urine te detecteren. Dit komt door de gele kleur van de urine zelf.
De xantoproteïnereactie wordt steeds vaker gebruikt om aminozuren zoals tryptofaan en tyrosine in verschillende eiwitten te kwantificeren.
