Flowcytometrie is een cytologische onderzoeksmethode die wordt gebruikt voor diepgaande analyse van cellen. Het voordeel is dat je elke cel afzonderlijk kunt bestuderen. Dit type analyse helpt om binnen enkele seconden verschillende parameters in honderden cellen te evalueren. Als gevolg hiervan wordt cytofluorimetrie beschouwd als een van de snelste en meest nauwkeurige analysemethoden die momenteel beschikbaar zijn voor wetenschappers en clinici.
Principe
Het principe van flowcytometrie is gebaseerd op het meten van lichtverstrooiing en luminescentie (fluorescentie) van cellen. De celsuspensie wordt als een stroom met hoge snelheid door de cytometercel geleid, waar het wordt bestraald met een laser. Daar wordt ook de zogenaamde hydrodynamische focussering uitgevoerd. Het mechanisme is dat de stroom van de cel met de bestudeerde deeltjes bij de uitlaat in de externe straal stroomt, die een hogere snelheid heeft. Als resultaat worden deeltjes uitgelijnd in een geordende keten.
Pre-cellen zijn gelabeld met speciale fluorescerende kleurstoffen (fluorochromen). Dankzij hen is de laserstraalwekt een secundaire gloed op. De ontvangen lichtsignalen worden geregistreerd door detectoren. Vervolgens wordt de informatie verwerkt met behulp van software-algoritmen waarmee u individuele celpopulaties kunt tellen die op sommige criteria verschillen.
Onderzoek met conventionele microscopie slaagt er vaak niet in om onderscheid te maken tussen verschillende cellen omdat ze er hetzelfde uitzien. Cytofluorimetrie kan andere gegevens opleveren (integriteit van de DNA-structuur), eiwitexpressie en celoverleving analyseren.
Omdat de excitatie van fluorochromen lichtstralen met verschillende golflengten en verschillende soorten detectoren vereist, zijn moderne installaties uitgerust met verschillende detectiekanalen (van 4 tot 30). Het aantal laserstralers kan van 1 tot 7 zijn. Complexere apparaten maken onderzoek met meerdere parameters mogelijk van verschillende eigenschappen van deeltjes tegelijk.
Voor- en nadelen
De voordelen van flowcytometrie zijn onder meer:
- hoge verwerkingssnelheid (registratie van maximaal 30 duizend gebeurtenissen in 1 seconde);
- mogelijkheid om een groot aantal cellen te bestuderen (tot 100 miljoen in een steekproef);
- Kwantificering van de intensiteit van fluorescerend licht;
- analyse van elke cel;
- simultane studie van heterogene processen;
- automatische scheiding van gegevens door celpopulaties;
- kwaliteitsvisualisatie van resultaten.
Een ander kenmerk van deze technologie is dathet geanalyseerde deeltje kan worden gekleurd met verschillende fluorescerende oplossingen. Hierdoor vindt er een multi-parameter studie plaats.
De nadelen zijn onder meer de complexiteit van de technische apparatuur en de noodzaak van speciale monstervoorbereiding.
Cytometers
De eerste apparaten van dit type verschenen al in 1968 in Duitsland, maar werden veel later wijdverbreid. Momenteel kunnen alle apparaten die werken volgens de methode van flowcytometrie worden onderverdeeld in 2 typen:
- apparaten die fluorescerende straling (twee of meer golflengten), 10° en 90° lichtverstrooiing meten (detector met lage hoek en zijverstrooiing);
- apparaten die, naast het meten van verschillende cellulaire parameters, automatisch in groepen sorteren op basis van deze criteria.
De voorwaartse verstrooiingsdetector is ontworpen om de grootte van de cel te bepalen, en het zijverstrooiingsapparaat stelt u in staat informatie te verkrijgen over de aanwezigheid van intracellulaire korrels, de volumeverhouding van het cytoplasma en de kern.
Klassieke cytometers laten, in tegenstelling tot lichtmicroscopen, niet toe om een afbeelding van een cel te verkrijgen. De afgelopen jaren zijn er echter gecombineerde apparaten ontwikkeld die de mogelijkheden van een microscoop en een cytofluorimeter kunnen combineren. Ze worden hieronder besproken.
Beeldvormingscytometers
Voor instrumenten die worden gebruikt in klassieke flowcytometrie,één kenmerk is kenmerkend: als zeldzame gebeurtenissen worden geregistreerd in de populatie van geanalyseerde cellen, is er geen manier om te beoordelen wat hun essentie is. Deze deeltjes kunnen ofwel de overblijfselen zijn van dode cellen of een zeldzame groep daarvan. In conventionele apparaten worden dergelijke gegevens uitgesloten van de algemene stroom van gebeurtenissen, maar het zijn juist deze gegevens die van bijzondere waarde kunnen zijn voor wetenschappelijke en klinische analyse.
Met de nieuwe generatie beeldvormingsflowcytometers kunt u een beeld vastleggen van elke cel die in de stroom door de detectorzone gaat. Het is gemakkelijk te zien door op het overeenkomstige gebied van het diagram te klikken, dat op de computermonitor wordt weergegeven.
Toepassingsgebieden
Flowcytometrie is een universele methode die op veel gebieden van geneeskunde en wetenschap wordt gebruikt:
- immunologie;
- oncologie;
- transplantologie (transplantatie van rood beenmerg, stamcellen);
- hematologie;
- toxicologie;
- biochemie (meting van de zuurgraad in de cel, de studie van andere parameters);
- farmacologie (nieuwe medicijnen maken);
- microbiologie;
- parasitologie en virologie;
- oceanologie (de studie van fytoplankton om de toestand van waterlichamen en andere taken te beoordelen);
- nanotechnologie en microdeeltjesanalyse.
Immunologie
Het menselijke immuunsysteem bestaat uit een grote verscheidenheid aan cellen. Flowcytometrie in de immunologie maakt het mogelijk om hun structuur en functies te evalueren, dat wil zeggen om morfofunctioneleanalyse.
Dergelijk onderzoek helpt om de complexe aard van immuniteit te begrijpen. Celfenotypen veranderen als gevolg van activering door antigenen, de ontwikkeling van pathologieën en andere factoren. Cytofluorometrie kan subpopulaties van immuuncellen scheiden in een complex mengsel en al hun veranderingen in de tijd evalueren.
Oncologie
Een van de belangrijkste taken in de oncologie is de differentiatie van cellen op basis van hun type. Het principe van analyse door flowcytometrie in de oncohematologie is gebaseerd op het volgende fenomeen: wanneer een monster wordt behandeld met een speciale fluorescerende kleurstof, bindt het zich aan cytoplasmatische eiwitten. Na deling in actief prolifererende cellen neemt het geh alte met de helft af. Dienovereenkomstig neemt de intensiteit van celluminescentie tweevoudig af.
Er zijn andere manieren om prolifererende cellen te detecteren:
- gebruik van DNA-bindende kleurstoffen (propidiumjodide);
- gebruik van gelabeld uracil;
- registratie van een verhoogd expressieniveau van cycline-eiwitten, die betrokken zijn bij de regulatie van de celcyclus.
